2結(jié)果與分析

2.1解烴菌BD-2產(chǎn)生的生物表面活性劑性能

通過(guò)驅(qū)油試驗(yàn)、表面張力和乳化指數(shù)的測(cè)定對(duì)菌株BD-2產(chǎn)生的生物表面活性劑性能進(jìn)行分析，并與其他研究菌株比較，結(jié)果見(jiàn)表1。菌株BD-2產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)，能夠形成直徑約為9.0 cm的排油圈，可以將發(fā)酵液的表面張力由68.30 mN/m降到26.80 mN/m，乳化能力可達(dá)92.80%，與已發(fā)表的Shewanella sp.YY-1和Bacillus cereus GX7相比，菌株BD-2產(chǎn)生的生物表面活性劑具有較強(qiáng)的降低液面張力能力和乳化活性。

表1生物表面活性劑性能對(duì)比

2.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑的影響

由圖1可見(jiàn)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株BD-2的菌落數(shù)迅速增加，產(chǎn)生的生物表面活性劑量也隨之顯著增加，有效地降低了液面表面張力（P<0.05）。菌株BD-2進(jìn)入穩(wěn)定期后，其菌落數(shù)、生物表面活性劑量和發(fā)酵液表面張力均趨于穩(wěn)定，且差異不顯著（P>0.05）。其中，24 h時(shí)菌株BD-2產(chǎn)生的生物表面活性劑量達(dá)到最高（1.64 g/L），發(fā)酵液表面張力降到最低（28.1 mN/m），而48 h菌株BD-2的菌落數(shù)達(dá)到最多，為1.1×108CFU/mL，此時(shí)，生物表面活性劑量略有降低，而發(fā)酵液表面張力略微上升，與24 h時(shí)差異不顯著（P>0.05）。這可能是由于隨著時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液中養(yǎng)分不足，而微生物仍處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，代謝過(guò)程中會(huì)消耗生物表面活性劑來(lái)維持菌體數(shù)量。研究結(jié)果表明，菌株BD-2在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始產(chǎn)表面活性劑，表面活性劑量、表面張力與菌株BD-2的生長(zhǎng)相關(guān)，菌株BD-2的最適發(fā)酵時(shí)間為24 h。

2.3培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1碳源的篩選

碳源對(duì)微生物的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有重要的影響。由圖2可知，不同碳源對(duì)菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑量的影響不同，本實(shí)驗(yàn)將原油、礦物油作為一類(lèi)復(fù)雜碳源，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖作為簡(jiǎn)單碳源，進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，以簡(jiǎn)單碳源作為底物時(shí)，菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑的量顯著高于復(fù)雜碳源（P<0.05），其產(chǎn)表面活性劑量大小依次為葡萄糖>麥芽糖>蔗糖>原油>礦物油。同時(shí)以簡(jiǎn)單碳源為底物時(shí)，菌株BD-2能顯著降低發(fā)酵液表面張力（P<0.05），其發(fā)酵液表面張力大小依次為原油>礦物油>蔗糖>麥芽糖>葡萄糖。在簡(jiǎn)單碳源中，以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株BD-2產(chǎn)生的表面活性劑的量最高，為2.26 g/L，而表面張力最低，為32.7 mN/m。研究結(jié)果表明，簡(jiǎn)單碳源有利于菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑。因此，選擇葡萄糖為菌株BD-2的碳源。

2.3.2氮源的篩選

氮源在微生物生長(zhǎng)和酶的合成中起著重要作用。由圖3可得，氮源種類(lèi)對(duì)菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑的影響存在顯著差異，以硝酸銨、硝酸鈉和氯化銨為氮源時(shí)，菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑的量顯著高于尿素和硫酸銨（P<0.05），其產(chǎn)表面活性劑量大小依次為硝酸銨>硝酸鈉>氯化銨>硫酸銨>尿素；以硝酸銨、硝酸鈉和氯化銨為氮源時(shí)，菌株BD-2能顯著降低發(fā)酵液表面張力（P<0.05），表面張力大小依次為尿素>硫酸銨>氯化銨>硝酸鈉>硝酸銨。以硝酸銨為氮源時(shí)，表面活性劑量最高，為2.40 g/L，而表面張力最低，為29 mN/m。研究結(jié)果表明，硝酸銨有利于菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑，而硝酸鈉和氯化銨效果不明顯，因此，選擇硝酸銨為菌株BD-2的最適氮源。

2.3.3金屬離子的影響

不同Mn2+、Fe2+濃度對(duì)菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑的影響不同。由圖4可見(jiàn)，隨著Mn2+濃度的增加，表面活性劑量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而表面張力先下降后升高。Mn2+濃度0.5~1 g/L，表面活性劑量明顯升高，在1 g/L時(shí)，表面活性劑量最大，為2 g/L，而表面張力從30.9 mN/m下降到26.2 mN/m。在1%以后，表面活性劑量顯著下降（P<0.05），由2g/L下降到1.36 g/L，而表面張力顯著上升（P<0.05），由26.2 mN/m上升到39.2 mN/m。結(jié)果研究表明，菌株BD-2在Mn2+濃度為1 g/L的表面活性劑量最多，表面張力最小。因此，菌株BD-2的最適Mn2+濃度為1%。

由圖5可知，當(dāng)Fe2+濃度為0.2 g/L時(shí)，表面張力最大，可達(dá)66.4 mN/m，而表面活性劑量為1.22 g/L，當(dāng)Fe2+濃度是CK時(shí)，表面張力最小，為30.9 mN/m，此時(shí)的表面活性劑量為1.27 g/L，而當(dāng)Fe2+濃度為2 g/L時(shí)，表面活性劑量最大，為1.37 g/L，此時(shí)的表面張力為56.6 mN/m。分析可得，增加Fe2+后，菌株的表面張力明顯增加，表面活性劑量無(wú)顯著變化（P>0.05），F(xiàn)e2+對(duì)菌株BD-2產(chǎn)表面活性劑無(wú)促進(jìn)作用。

2.4環(huán)境因素對(duì)菌株產(chǎn)表面活性劑的影響

對(duì)菌株BD-2在不同的環(huán)境條件下進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。如圖6(a)所示，pH在5~7之間，生物表面活性劑量明顯增加，在pH為7時(shí)，表面活性劑量最高，為1.64 g/L，而發(fā)酵液表面張力由34.3 N/m下降到28.2 mN/m。pH大于7后生物表面活性劑量顯著下降（P<0.05），表面活性劑量由2.01 g/L下降到1.57 g/L。pH為7后表面張力顯著上升（P<0.05），表面張力由28.2 mN/m升高到31.1 mN/m。研究結(jié)果表明，菌株BD-2在pH為7時(shí)生物表面活性劑量最多、表面張力最低，因此，菌株BD-2的最適發(fā)酵pH為7。

由圖6(b)可得，在10~30℃表面活性劑量明顯增加，在30℃時(shí)表面活性劑量達(dá)到最大，為2.18 g/L，表面張力明顯降低，從38.2 mN/m降低到23.2 mN/m；而溫度超過(guò)30℃后表面活性劑量顯著下降（P<0.05），表面活性劑量由2.18 g/L降低到0.85 g/L。表面張力顯著增加（P<0.05），表面張力由23.2 mN/m增加到35.1 mN/m。

研究結(jié)果表明，菌株BD-2在30℃時(shí)表面活性劑量最多，表面張力最低，因此，石油降解菌BD-2的最適發(fā)酵溫度為30℃。

如圖6(c)所示，在鹽濃度0.5%~1%之間，表面活性劑量明顯增加，在1%時(shí)，表面活性劑量最大，為2.6 g/L，表面張力明顯下降，降低到26.8 mN/m。隨著鹽濃度繼續(xù)增加，菌株BD-2表面活性劑量下降到1.5 g/L。鹽濃度在3%以后，表面張力顯著上升（P<0.05），表面張力由26.8 mN/m升高到53.8 mN/m。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株BD-2在鹽濃度1%時(shí)表面活性劑量最多，表面張力最低。因此，石油降解菌BD-2的最適鹽濃度為1%。

2.5環(huán)境因素對(duì)生物表面活性劑穩(wěn)定性的影響

研究了石油降解菌BD-2產(chǎn)生的生物表面活性劑在不同pH、溫度和NaCl濃度下的穩(wěn)定性。如圖7(a)所示，在pH小于4時(shí)，萘濃度顯著下降（P<0.05），發(fā)酵液的表面張力顯著上升（P<0.05）。當(dāng)pH為4~10時(shí)，表面張力和萘濃度沒(méi)有顯著變化（P>0.05），當(dāng)pH為10~12時(shí)，隨著pH的增加，發(fā)酵液中萘濃度下降，而表面張力此時(shí)上升，并且差異都顯著（P<0.05）。結(jié)果表明該菌產(chǎn)生的生物表面活性劑具有較好的耐酸堿能力。

如圖7(b)所示,當(dāng)環(huán)境溫度低于20℃或大于70℃時(shí)，萘濃度均低于21 mg/L，液體表面張力也略微上升，說(shuō)明低溫和高溫會(huì)影響生物表面活性劑對(duì)萘的增溶能力，但對(duì)液體表面張力影響不大。在20~70℃時(shí)，萘濃度和液體表面張力呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，但差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，解烴菌BD-2產(chǎn)生物表面活性劑在20~70℃時(shí)具有良好的萘的增溶能力和降低液面張力的作用。

如圖7(c)所示,隨著NaCl濃度增加，萘濃度顯著下降（P<0.05），但NaCl濃度在8%以?xún)?nèi)，萘濃度均高于21 mg/L，表明生物表面活性劑對(duì)萘的增溶穩(wěn)定；而液體表面張力總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中，NaCl濃度12%以?xún)?nèi)，液體表面張力變化不顯著（P>0.05），說(shuō)明菌株BD-2產(chǎn)的生物表面活性劑能夠在一定鹽度范圍內(nèi)，較好地降低液面張力。